Melhoramento genético e marcadores moleculares - presente e futuro

MELHORAMENTO GENÉTICO E MARCADORES MOLECULARES - PRESENTE E FUTURO
Diêgo Henrique Serrano¹, Fausto Moreira da Silva Carmo², Samuel Colombi da Silva¹, Hugo Bicalho Carmo¹, Thiago Rody¹
¹ - Acadêmicos do curso de Medicina Veterinária da Faculdade de Castelo.
² - Professor do curso de Medicina Veterinária da Faculdade de Castelo.
O melhoramento genético assistido através de marcadores moleculares já é uma realidade em programas genéticos com animais e plantas. Esta tecnologia superou os problemas de instabilidade e baixa precisão dos marcadores morfológicos através da detecção direta de diferenças entre alelos na sua sequência no DNA. Nos últimos anos diversas estratégias levaram à identificação de marcadores moleculares associados com características importantes nas cadeias produtivas da pecuária mundial.
Os trabalhos iniciais para desenvolver e caracterizar marcadores moleculares para espécies de interesse zootécnico iniciaram-se no início dos anos 80, onde as primeiras publicações relatavam resultados de estudos de caracterização de marcadores RFLP (do inglês Restriction Fragment Length Polymorphism) que foram utilizados em suínos e bovinos. Entretanto estes estudos iniciais apresentavam metodologias trabalhosas e com muitos limites, apesar de terem sido considerados renovadores na época, uma vez que as alternativas disponíveis resumiam-se em estudos com grupos sanguíneos e aloenzimas. Tipicamente, para produzir um dado molecular (um genótipo) eram necessários em média cinco dias de trabalho, usando radioisótopos e enfrentando várias questões técnicas que dificultavam o trabalho (GEORGES et al. 1987). (PALMITER et al. 1982).
Após esses trabalhos realizados, os primeiros estudos para isolar e caracterizar marcadores do tipo SSR (Simple Sequence Repeats). Esforços significativos foram empregados para identificar microsatélites em bovinos, suínos e eqüinos. Essas metodologias trouxeram muitos benefícios para o melhoramento. Inicialmente a genotipagem desses marcadores eram realizadas com o uso de radioisótopos. Posteriormente, com a invenção dos equipamentos, os sequenciadores automáticos, se tornou possível utilizar fluorocromo para detecção dos variantes alélicos. Os primeiros mapas genéticos abrangentes para espécies de interesse zootécnico foram construídos com marcadores microssatélites (GUERINET al., 2003).
Com a descoberta da estrutura molecular dos ácidos nucléicos (DNA e RNA) e do melhor entendimento dos eventos como replicação, transcrição e tradução, vários métodos foram desenvolvidos para simular esses eventos in vitro, permitindo a análise do DNA com o objetivo de identificar e caracterizar polimorfismos. As técnicas modernas de biologia molecular, especialmente a técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), que fornece bilhões de cópias de um fragmento alvo de DNA utilizando uma DNA polimerase termoestável, facilitaram enormemente a detecção de polimorfismos genéticos diretamente no DNA (GONÇALVES et al., 2005). A PCR para sintetizar uma fita nova de DNA, necessita de um par de oligonucleotídeos iniciadores ou primers (uma única fita curta de DNA, específica para o gene que se quer estudar) que complementam a fita oposta da sequência de DNA a ser amplificada (uma amostra de DNA a ser identificada) e de precursores de síntese de DNA, chamados dNTPs (desoxinucleotídeos tri-fostato ou dATP, dTTP, dCTP e dGTP). Depois da desnaturaçãodo molde de DNA mediada pelo calor, 94 - 96°C, a temperatura é reduzida (50- 68°C) ocorrendo a ligação dos primers a sua sequência respectiva no molde de DNA, o que é denominado de anelamento, a temperatura é elevada para 72°C, e então a enzima, DNA-polimerase, sintetiza uma fita complementar em direção à extensão5' e3' duplicando, assim, a sequência alvo escolhida. Os ciclos de desnaturação, anelamento e extensão são repetidos várias vezes. Teoricamente, em cada ciclo a quantidade de moldes de DNA dobra, pois os produtos de um ciclo servem de molde para o ciclo seguinte e, portanto, depois de 10 ciclos a sequência alvo dentro do molde de DNA é multiplicada por 1.000 e, após 20 ciclos, é multiplicada por 1.000.000, levando ao aumento exponencial do número de cópias do DNA amplificado (MULLIS, 1990).
Os distintos tipos de marcadores moleculares hoje disponíveis diferenciam-se pela tecnologia utilizada para revelar variabilidade a nível de DNA, e assim variam quanto à habilidade de detectar diferenças entre indivíduos, custo, facilidade de uso, consistência e repetibilidade. Os principais tipos de marcadores moleculares podem ser classificados em dois grupos, conforme a metodologia utilizada para identificá-los: hibridização ou amplificação de DNA. Entre os identificados por hibridização estão os marcadores RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) e minissatélites ou locos VNTR (Variable Number of Tandem Repeats). Já aqueles revelados por amplificação incluem os marcadores do tipo: RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions), STS (Sequence Tagged Sites), Microssatélite e AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism). As principais etapas requeridas para obtenção de resultados variam com o tipo de marcador molecular utilizado (PARAN, MICHELMORE, 1993).
Devido a essas novas tecnologias o Brasil segue a tendência mundial na busca de maior eficiência e qualidade na produção de alimentos destinados à população humana em constante crescimento. A pecuária moderna baseia-se na intensificação da atividade, tanto em relação à busca de qualidades produtivas dos animais, quanto ao aumento da velocidade do ciclo de produção, favorecendo a maior produção por área/ano (MILAZZOTTO, 2001). Para manter a competitividade comercial num cenário de mercados internos e externos em desenvolvimento, a agroindústria brasileira vêm investindo em programas de melhoramento genético buscando aumentar a eficiência da produção, padronização dos animais e de seus produtos. Com base no conhecimento de que as características fenotípicas são herdáveis, e com auxilio de marcadores moleculares, possibilitou-se um grande beneficio no que diz respeito o aumento da produção, a capacidade e a velocidade de crescimento e ganho de peso dos animal e animais mais resistente a certos tipos de doenças. Essas características são preditas e utilizadas na elaboração de índices que são utilizados como critério de seleção para o melhoramento genético (CARVALHO, 2008).
Um exemplo que pode ser observado e que, é característico no melhoramento genético em suínos, é o gene halotano, conhecido também como gene do estresse, que pode levar a causar um aumento nas mortes súbitas em animais submetidos a situações de estresse (FÁVERO, BELLAVER, 2007; REGINATO; COUTINHO, 2001). Os animais que apresentam este tipo de gene possuem um desenvolvimento muscular superior ao dos animais que não apresentam, tornando-se mais susceptíveis a problemas de qualidade de carne, como PSE (carne de coloração pálida, macia e com perda de água) (FÁVERO; BELLAVER, 2007; REGINATO; COUTINHO, 2001). Pode se observar também que os cruzamentos de machos terminais heterozigotos (HalNn) com fêmeas homozigotas livres do alelo recessivo (HalNN) tem o objetivo de obter uma progênie 50% HalNn e 50% HalNN, com um aumento de 1 a 2% no conteúdo de carne nas carcaças e, supostamente, sem prejuízo para a qualidade da mesma (FÁVERO; BELLAVER, 2007). Outro exemplo e o gene da carne ácida que é dominante, caracterizado por causar uma perda no rendimento industrial durante o processamento de produtos curados e cozidos, devido à baixa quantidade de proteína na carne e a um pH final baixo, provocado por um alto conteúdo de glicogênio nas fibras brancas dos músculos e por isto foi denominado de RN pelo fato de ter sido estudado pela primeira vez em avaliações do rendimento de Presunto Napole (FÁVERO; BELLAVER, 2007). Em suínos vem sendo estudada a influência do polimorfismo no gene receptor de estrogênio (ESR) em características reprodutivas como o tamanho de leitegadas (REGINATO; COUTINHO, 2001). Segundo Short e colaboradores (1997) em seus experimentos com linhagens da raça Chinesa Meisham que o gene ESR aumenta em0,8 a 1 leitão por leitegada para cada cópia desse alelo e para animais homozigotos para o gene ESR o acréscimo foi de1,6 a 2 leitões por leitegada.
Com o avanço das pesquisas de melhoramento genético utilizando marcadores moleculares, essas característica maléficas determinadas por genes específicos, podem ser melhor identificadas e analisadas, e a partir dos resultados obtidos, pode estabelecer um programa de melhoramento que descarte os animais em que estes genes estejam presentes.
As perspectivas futuras mostram um grande avanço muito importante na questão de marcadores moleculares uma delas são os chips de genotipagem de alta densidade disponíveis para espécies de interesse zootécnico, onde estão sendo extensamente utilizados por grupos do mundo para desenvolvimento de ferramentas de seleção genômica. No caso dos bovinos, embora os chips atuais sejam adequados para estudos com a maioria das raças taurinas, os estudos em andamento revelaram que em certas raças, principalmente do grupo zebuíno, os marcadores contidos nos chips apresentam informatividade reduzida. Com isso, um número significativo de marcadores não pode ser utilizado nas análises por estar fixado na raça ou por apresentar MAF (Minor Allele Frequency) próxima a zero. Negociações para desenvolvimento de novos chips, com mais marcadores, derivados de um número maior de raças, estãoem andamento. A única certeza que se tem do futuro é que os próximos anos trarão grandes e estimulantes avanços para o melhoramento animal (EID et al., 2009).
Portanto devido ao aumento da demanda por produtos de origem animal, pela necessidade da população mundial em consumir estes, vem sendo de grande valia os estudos de melhoramento genético com auxilio dos  marcadores moleculares em  animais de produção, que apresentam como objetivo principal, a seleção de animais que possam  transmitir características excelentes na produção, gerando produtos com  menor tempo e com uma melhor  qualidade, e também na obtenção de maiores lucros para os produtores.
REFERÊNCIA
CARVALHO, M.E. Cracterização da frequência de polimorfismos em genes ligados a maciez de carne da raça Nelore. 2008.56f. Dissertação (Mestrado) Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo.
EID, J.; FEHR, A.; GRAY, J. et al. Real-time DNA sequencing from single polymerase molecules. Science, v.323, n.5910, p.133-138, 2009.
GEORGES, M.; LEQUARRÉ, A.S.; HANSET, R.; VASSART, G. Genetic variation of the bovine thyroglobulin gene studied at the DNA level. Animal Genetics, v.18, n.1, p.41-50, 1987.
GONÇALVES, T.M. ; OLIVEIRA, H.N. ; BOVENHUIS, H. ; BINK, Marco ; ARENDONK, Johan Van . Detecção de locos de características quantitativa(QTL) afetando o crescimento e a carcaça de suínos. R. Soc. Bras. Zootec., v. 34, p.1540-1552, 2005.
GUÉRIN, G.; BAILEY, E.; BERNOCO, D. et al. The secondgeneration of the International Equine Gene Mapping Workshop half-sibling linkage map. Animal Genetcis, v.34, n.3, p.161- 168, 2003.
MILAZZOTTO, M. P. Mutações no gene do receptor do hormônio luteinizante (LHR) bovino e associaçãocom precocidade sexual em fêmeas Bosprimigeniusindicus(Nelore). Dissertação de Mestrado. Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista – campus de Botucatu, 2001.
MULLIS, K. (1990). The unusual origin of the polymerase chain reaction.Scientific15 American April 56-65
PALMITER, RD, BRINSTER RL, HAMMER RE, TRUMBAUER ME, ROSENFELD MG, BIRNBERGNC, EVANS RM (1982) Dramatic growth of mice that develop from eggs microinjected with metallothionein-growth hormone fusion genes. Nature 300: 611-615.
PARAN, I.; MICHELMORE, R.W. 1993. Development of reliable PCR-based markers linked to downy mildew resistance genes in lettuce. Theor. Appl. Genet., 85:985-993.
REGITANO, L. C. A.; COUTINHO, L. L. Biologia Molecular aplicada à ProduçãAnimal. Brasília: EMBRAPA, 2001.